Práctica 41: Prueba de mezcla con plasma normal

PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL

Fundamento:

Se práctica cuando en el plasma problema se determina un TP normal u un TTPA alargado. Se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca en concreto  el factor VIII, IX,XI o XII.

Se mezcla el PPP problema con PPP normal y se repite la determinación del TTPA pero en la mezcla preparada y no en el PPP problema puro.

Si el TTPA determonado en la mezcla se corrige, falta, en el plasma problema, alguno de los factores de la vía intrínseca que está presente en el PPP normal.

Si el TTPA de la mezcla no se corrige, con respecto al de PPP problema puro, el transtorno coagulatorio se debe a otros motivos como en sustancias inhibidoras de la coagulación.

Muestra:

• Plasma pobre en plaquetas (PPP)

Material:

• Gradilla
• Dos cubetas de coagulómetro
• Dos trocitos de acero
• Pipeta de 100ul
• Coagulómetro
• Tubos de ensayo de plástico 

Reactivos:

• Cloruro cálcico
• Cefalina
• Pool de plasma 

Procedimiento:

1. Cogemos un tubo de plástico y echamos 55 ul de PPP y 55 ul de serican anormal y lo metemos en el baño de agua a 37 durante 15 minutos.
2. Lo sacamos y ponemos en la cuneta 100 ul del tubo anterior e introducimos el trocito de acero y lo ponemos en el coagulómetro durante 2 minutos. 
3. Ponemos 100ul de cefalina y lo introducimos en la celdas de medida y lo tapamos con el tapón rojo.
4. Le añadimos 100 ul de cloruro cálcico y esperamos a leer los resultados.

Resultados:

El TTPA es el tiempo transcurrido desde que se le echa el CaCl2 hasta la formación del coágulo de fibrina.

Los valores normales del TTPA oscilan entre 30 y 40 segundos.

Un tiempo superior a este se considera alargado.

Como el TTPA de la dilución de la muestra de hace dos veces, se calcula la cifra media de los valores.

El resultado ha sido de 70 seg.

Hoja de trabajo

1. ¿Cuándo debe hacerse la prueba de mezcla con plasma normal?

- cuando en el plasma problema de determina un TP normal y un TTPA alargado.

2. Si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿qué se debe investigar?

- Se debe investigar la presencia en el plasma de un inhibidor de la coagulación ( heparina, PDF...)

Práctica 40: Determinación del fibrinógeno

DETERMINACIÓN DEL FIBRINÓGENO

Fundamento:

El fribrinógeno en presencia de trombona se transforma en fibrina. El tiempo de formación del coágulo es proporcional a la concentración de Fibrinógemo presente en la muestra de plasma.
La determinación del fibrinógeno por el tiempo de coagulación de trombina, se basa en el método de Clauss. En presencia de altas concentraciones de trombina, el tiempo necesario para la formación del coágulo en el plasma diluido es proporcional a la concentración de fibrinógeno.

Material:

• 6 tubos de ensayo de plástico
• Pipeta de 100 y 200 ul 
• Pipet graduada de 5 ml
• 6 cubetas de coagulómetro
• coagulómetro 

Reactivos:

• Trombina bovina ( R1)
• Tampón Imidazol (R2)
• Solución de Caolín (R3)
• Coagulation cal 

Muestra:

• Plasma pobre en plaquetas (PPP)

Procedimiento:

1. Rotulamos los 5 tubos con 1/40,1/30,1/20,1/10,1/5 y un tubo que contenga 50ul de muestra + 450 ul de tampón Imizadol.
2. Echamos en cada tubo las cantidades de la siguiente tabla:

                     

1/40    1/30    1/20.   1/10.    1/5

Tampón Imizadol (ml)                                    3.9     2.9       1.9     0.9      0.4

Coagulation cal (ml)                                      0.1      0.1       0.1     0.1      0.1

     3. Cogemos 5 cubetas y los rotulamos con 1/40, 1/30, 1/20, 1/10, 1/5
     4. Echamos 200 ul de los tubos anteriores y añadimos 20 ul de R3 (caolin)
     5. Lo ponemos debajo de la celda de medida y echamos 100 ul de R1 (trombina bovina)

Resultados:

Concentración (mg/dl)	Tiempo (seg)
478	11.7
239	15.6
119.5	21.7
78.87	45.2
59.75	46.9

          

Hoja de trabajo 

1º. ¿ De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?

- Plasmático

2º. ¿ A qué concentración está la trombina bovina?

- 100 u NIH/ml

3º. ¿A qué dilución se somete a la muestra?

- 1/10

4º. ¿ Cuál es la fibrinoogenemia normal?

- entre 150 y 450 mg/dl

Práctica 39: Preparación de una curva de actividad de la protrombina

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA

Fundamento:

Para construir un curva de actividad de la protrombina se perpara una batería de diluciones a partir sw un plasma control normal, y se mide el TP del plasma control normal no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.
Se asigna el 100% de actividad al número de segundos medidos en la determinación del TP del plasma normal puro, y se calcula el porcentaje que les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las disoluciones de éste.

Material:

• 5 tubos de plástico
• Pipeta de 100 y 200 ul
• 5 cubetas de coagulómetro
• coagulómetro
• gradilla 
• Pipeta de 1 ml

Reactivos:

• Tromboplastina cálcica
• Solución salina
• Pool deplasma

Muestra:

• Plasma pobre en plaquetas (PPP)

Procedimiento:

1. Rotulamos 5 tubos con 100, 50, 33,25, 10
2. Echamos las cantidades que nos indica la tabla:

	100	50	33	25	10
pool de plasma	200	200	200	200	200
Solución salina	0	200	400	600	1.800

    3. Cogemos 5 cubetas y las rotulamos con 100, 50, 33, 25, 10 y echamos 100 ul de cada tubo anterior y atemperamos 5 min. en el coagulómetro.

     4. Vamos poniendo las cubetas debajo de la celda de medida y añadimos 100 ul de tromboplastina cálcica.

      5. Anotamos los resultados.

Resultados:

• Plasma 100% diluido: 12,3
• Plasma 50%: 19
• Plasma 33%: 25,3
• Plasma 25%: 32,4
• Plasma 10%: 61,3

Hoja de trabajo

1º. ¿Con qué se diluye el pool  de plasma normal o el pool control normal?

- Con solución salina.

2º. ¿ Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?

- 50%

3º. ¿ Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?

- Cuando echamos la tromboplastina cálcica.

4º. ¿ Qué se anota en el eje de ordenadas?

- El % de actividad.

Práctica 38: Determinación del tiempo de protombina (TP)

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE PROTOMBINA (TP)

Fundamento:

El reactivo utilizado para la realización de la prueba es una mezcla de tromboplastina hística (TH) y de calcio.

La TH procede de cerebros o pulmón de hombre o animales.

Material:

• Gradilla
• Cubeta de coagulómetro
• Trocito de acero
• Rotulador
• Pipeta automática de 100 y 200 ul
• Coagulómetro
• Baño de agua 
• 2 tubos de ensayo de plástico

Reactivos:

• Tromboplastina cálcica

Muestra:

• Plasma pobre en plaquetas (PPP)

Procedimiento:

1. Para diluir la tromboplastina cálcica se echa en el bote de reactivo la cantida de agua destilada que indique.
2. Atemperamos el reactivo en el coagulómetro.
3. Cogemos una cubeta y lo rotulamos con la letra M y echamos 100 ul de PPP
4. Introducirlo en la celda de medida y echarle 200 ul de tromboplastina cálcica y anotamos el resultado.

Resultados:

TP: 5,1 

IRN= (TP del paciente/TP control normal)elevado al ISI

Hoja de trabajo

1º. ¿Qué índice expresa la sensibilidad de una tromboplastina hística?

- Tiempo de protrombina

2º. ¿Cómo se llama la ratio de protombina corregida?

- IRN

3º. ¿Cuál es el % normal de actividad de la protombina?

- Entre 70 y 100

4º. ¿En qué circunstancias se altera el TP?

-  En enfermos sometidos a terapias con dicumarinas y en pacientes que sufren transtornos hepáticos.

Práctica 37: Determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA)

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVA (TTPA)

Fundamento:

La racalcificación del PPP se realiza mediante la adixión de una solución de cloruro cálcico.

El sustituto del f3p consiste en una suspensión de fosfolípidos, obtenida a partir de cerebros de conejo llamada cefalina.

Material:

• Gradilla
• 2 cubetas de coagulómetro
• 2 trocitos de acero
• Rotulador
• Pipeta de 400ul
• Coagulómetro
• 4 tubos de ensayo de plástico

Reactivos:

• Cloruro cálcico
• Cefalina 
• Pool de plasma o plasma control

Muestra:

• Plasma pobre en palquetas.

Procedimiento:

1. Rotulamos dos tubos de plástico con la letra M y con la letra C
2. Añadimos 100 ul de plasma control y 100 ul de la muestra en el tubo M
3. Añadimos 100 ul de cefalina a cada tubo
4. Ponemos las cubetas en la celda de medida y ehamos 100 ul de CaCl2.

Resultados:

TTPA muestra: 116.6 seg
TTPA control: 28.1 seg
Diferencia entre TTPA de la muestra y el TTPA de control: 116.6-28.1= 88.5seg
Cociente entre TTPA de la muestra y el TTPA de control: 116.6/28.1= 4.14 seg

Hoja de trabajo

1º. ¿De dónde se obtiene el sustituto de f3p?

-  de cerebros de conejo

2º.¿Cómo se llama el sustituto del f3p?

- Cefalina

3º.¿Qué activadores de los factores sw contacto se pueden utilizar?

- El caolín, el polvo de vidrio, el sílice, el celite y el ácido elágico.

4º.¿Cuántos segundos debe superar el TTPA de la muestra al de control para ser considerado anormal?

- 8 seg.

Práctica 36: Determinación del test de howell

DETERMINACIÓN DEL TEST DE HOWELL

Fundamento:

Se vierte el PRP (plasma rico en plaquetas) en un tubo de vidrio y se añade cloruro cálcico (CaCl2) y se incuba a 37ºC.

El resultado es el tiempo transcurrido desde echamos el CaCl2 hasta la coagulación de éste.

Material:

• Rotulador
• 2 tubos de hemólisis de vidrio
• Pipeta graduada de 100 ul
• Baño de agua 
• Cronómetro

Reactivos:

• Cloruro sódico (solución salina)
• Cloruro cálcico
• Plasma control normal o pool de plasma normal

Muestra:

• Plasma rico en plaquetas.

Procedimiento:

1. Llenamos los tubos de hemólisis con sangre y lo metemos en la centrífuga a 2000 rpm durante 15 min para sacar el plasma.
2. Echamos el plasma en otro tubo 
3. Rotulamos los tubos de hemólisis con la letra M y con la letra C.
4. Echamos 100 ul de muestra en el tubo M y 100 ul de pool de plasma en el tubo C
5. A la mezcla anterior, echamos 100 ul de solución salina a cada tubo
6. Echar 100 ul de CaCl2 a la vez y poner en marcha el cronómetro
7. Parar el cronómetro cuando aparezca un enturbiamiento y una solidificación de la mezcla de plasma y de reactivos.

Resultados:

El resultado del test de Howell es el tiempo transcurrido, desde que se pone el cronómetro hasta que se para.

• Tiempo que tarda en coagular la muestra: 130 seg
• Tiempo que tarda en coagular el control: 135 seg

Hoja de trabajo

1º. ¿Qué tipo de muestra se utiliza en esta prueba?

- Plasma rico en plaquetas.

2º.¿A qué concentración está el CaCl2?

- A 0.025M

3º.¿Cuáles son los valores normales del test de Howell?

- Entre 90 y 130 seg.

4º.¿Qué tratamiento puede ser controlado con este test?

- CaCl2

Práctica 35: Determinación del tiempo de hemorragia con la técnica de Duke

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE HEMORRAGIA CON LA TÉCNICA DE DUKE

Fundamento:

El tiempo de hemorragia se determina efectuando una pequeña herida en la piel y, midiendo el tiempo que tarda en cesar de manar sangre a través de la herida.

Material:

• Algodón
• Lanceta
• Cronómetro

Reactivos:

• Alcohol

Procedimiento:

1. Limpiamos el lóbulo de la oreja con alcohol y algodón.
2. Pinchamos el lóbulo con la lanceta y ponemos el cronómetro.
3. Dejar que salga la sangre sin hacer presión
4. Recoger las gotas de sangre con el papel de filtro cada 30 seg.
5. Parar el cronómetro cuando ya no salga más sangre.

Resultados:

El tiempo de hemorragia es el indicado por el cronómetro, es decir, el transcurrido desde que se ha puesto en marcha éste hasta que se ha parado.

Se puede calcular el tiempo de hemorragia multiplicando el número de manchas de sangre más una por 30 seg.

• Número de manchas de sangre que han quedado marcadas en el papel de filtro:
• tiempo transcurrido,desde que se ha puesto en marcha el cronómetro, hasta que se ha parado éste:

Hoja de trabajo

1º. ¿ De qués es la técnica que se utiliza, en esta práctica, para determinar el tiempo de hemorragia?

- Técnica de Duke

2º.¿ Cada cuánto tiempo se recoge la gota de sangre qye está presente en el lóbulo de la oreja?

- cada 30 seg.

3º. ¿Cuál es el tiempo de hemorragia normal?

- En 1 a 3 min.

4º.¿Qué fármaco aumenta, tras ser ingerido, el tiempo de hemorragia?

- El ácido acetilsalicílico.

Práctica 34: Prueba de Rumpel-Leede

PRUEBA DE RUMPEL-LEEDE

Fundamento
Se aplica un torniquete en el brazo, esto origina un aumento en la presión intracapilar y una anoxia, que son los responsables de la posible producción de extravasaciones sanguíneas, en forma de petequias.

Material:

• Esfigmomanómetro
• Fonendoscopio
• Reloj

Procedimiento:

1. Medimos la presión arterial y calculamos la media entre la presión sistólica y la presión diastólica.
2. Hacemos un círculo en el antebrazo a unos 5 cm del codo.
3. Colocamos el esfigmomanómetro en el brazo y lo insuflamos de aire hasta llegar al número que nos ha dado antes.
4. Lo dejamos 5 min.
5. Aflojamos el manguito y contamos las petequias que nos ha salido dentro del círculo.

Resultados:

Una vez que hemos hecho las pruebas, no hemos podido encontrar ninguna petequia.

Es negativo si hay menos de 10 petequias, dudoso entre 10 y 20 petequias y positivo cuando hay más de 20 petequias.

Hoja de trabajo

1º. ¿Cuánto tiempo se deja puesto el esfigmomanómetro en esta prueba?

- 5 min.

2º. ¿Cómo se aprecian las petequias?

- Pequeñas manchas de color rojo

3º. ¿Cuántas petequias debe contener el círculo para que el resultado sea claramente positivo?

- 20 petequias

4º. ¿En qué enfermedades hay una prueba de Rumpel-Leede positiva?

- en la enfermedad de Von Willebrand, en el escorbuto y en las púrpuras vasculares.

Práctica 33: Determinación de la Velocidad de Sedimentación Globular (VSG)

DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

Fundamento:

Se coloca la sangre problema en ele interior de un tubo. En condiciones normales los glóbulos rojos tienden a ir cayendo hacia el interior del tubo.

El proceso es lento porque la fuerza con la que es atraído cada hematíe hacia el fondo es compensada por la fuerza ascendente creada por el plasma al desplazarse hacia arriba.

La VSG equivale a la longitud del recorrido que desciende la columna de eritrocitos, desde la parte superior del tubo hacia abajo.

Material:

• Pipeta
• Tubo con tapón negro

Reactivos:

• Citrato sódico

Muestra:

• Sangre venosa anticoagulada con citrato sódico

Procedimiento:

1. Cogemos la pipeta y la introducimos en el tubo negro 
2. Lo llenamos hasta el cero y lo dejamos una hora y dos horas

Resultados:

Índice de Katz= VSG 1º h + VSG 2º h/2 /2

Í. de Katz= 4 mm+ 20mm/2 /2= 20 mm

Hoja de trabajo

1º. ¿ Cómo se llama la carga electrostática negativa de los glóbulos rojos?

- Potencia zeta.

2º. ¿Qué anticoagulante es el más apropiado ara realizar una determinación de VSG?

- Citrato sódico

3º. ¿ A qué temperatura se recomienda practicar la determinación de VSG?

- 27 ºC

4º. ¿ Qué ocurre si la pipeta de VSG está inclinada durante la determinación?

- Que no baja al mismo ritmo

5º. ¿ A qué tiempo se efectúa la lectura de la VSG?

- A la primera hora y a la segunda hora.

6º. ¿ En qué circunstancia fisológicas aumenta la VSG?

- En presencia de patologías

Práctica 32: Prueba de la sacarosa

PRUEBA DE LA SACAROSA

Fundamento:

La prueba de la sacarosa consiste en situar los hematíes problema en un medio de baja fuerza iónica. En este medio los eritrocitos tienden a fijar el complemento, por lo que cuando los glóbulos rojos presentes en la muestra tienen una sensibilidad alta al complemento, tienden a lisarse.

Material:

• Pipeta Pasteur
• Tres pipetas graduadas ( 1 de 5 ml, 2 de 2 ml y 3 de 0,5 ml)
• Pipeta automática de 100 ul
• Puntas de puntas
• 6 tubos de centrífuga
• Reloj
• Centrifugadora
• Espectofotómetro
• Cubetas de espectofotómetro
• Gradilla.

Reactivos:

• Solución acuosa de sacarosa
• Suero fisiológico

Muestra:

• Sangre venosa

Procedimiento:

1. Cogemos tres tubos de ensayo y lo rotulamos con tubo SF, tubo SC y tubo SP
2. Rellenamos los tubos según la tabla:

	Tubo SF	Tubo SC	Tubo SP
Suero fisiológico (ml)	1.8
Solución de sacarosa (ml)		1.8	1.8
Sangre control (ml)		0.2
Sangre problema (ml)	0.2		0.2

3º. Agitamos los tubos suavemente

4º. Dejamos reposar 30 min
5º. Centrifugamos los tubos a 2000 rpm durante 5 min.

Sobrenadante del tubo SP                            0.3
Líquido resuspendido del tubo SF                0.3

Resultados:

• TB: 0
• TPr: 0.07
• TPa: 0.438

% de hemólisis= A/AM x 100 = 1.60 % 

Hoja de trabajo

1º. ¿Con qué solución se hemolizan los hematíes vertidos en

 el tubo problema?

- solución sacarosa

2º. ¿ A qué concentración se prepara la solución de 

sacarosa?

- Concentración 9.24%

3º. ¿ Como se llama también la sacarosa?

- Azúcar

4º. ¿ Qué es el ACD?

- Anticoagulante

5º. ¿ Cómo se prepara el tubo blanco?

-se prepara vertiendo 5 ml de solución 

aminiaco y 0,3ml de suero fisiológico.

6º. ¿Qué porcentaje de hemólisis suele producirse, con la 

prueba de la sacarosa, en la sangre de la HPN?

- Entre 10 y 80%

Práctica 31: Estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes

ESTUDIO DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS HEMATÍES

Fundamento:

El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decrciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Se enfrentan los hematíes problemas a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 g por mil ( solución hipotónica)

Cuando están en contacto con soluciones hipotónicas, entra agua a través de la membrana y se hinchan.Al hincharse los hematíes, una parte de la Hb que contienen puede salir al exterior a través de los poros de la membrana. Si al entrar líquido excesivo, los hematíes se rompen y dejan salir la Hb (hemólisis).

Por tanto, evalúa la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un aumento de su contenido acuoso.

Material.

• Pipeta Pasteur
• Tubos de centrífuga
• Reloj
• Centrifugadora
• Espectofotómetro
• cubetas de espectofotómetro
• Gradilla

Reactivos:

• Suero fisiológico
• Agua destilada

Muestra:

• Sangre venosa

Procedimiento:

1. Como hay 18 tubos, cogemos la mitad, es decir, del 1 al 4 y del 12 al 18 y los rotulamos poniendo los números.
2. Echamos en cada tubo 1 gota de sangre 
3. Echamos las gotas que nos indique de agua destilada según la tabla
4. Echamos las gotas que nos indique de suero fisiológico según la tabla.
5. Agitar suavemente y dejar 30 min.
6. Meter los tubos en la centrífuga a 2000 rpm durante 5 min.
7. Sacamos el sobrenadante y las ponemos en las cubetas y apuntamos las absorbancias.

Tubos   nº	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
Agua          destilada (gotas)	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
Suero fi- siológico (gotas)	18	17	16	15	14	13	12	11	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1
Conc.g/l	9	8.5	8	7.5	7	6.5	6	5.5	5	4.5	4	3.5	3	2.5	2	1.5	1	0.5

Resultados:

• Tubo 1: 0.248

% hemólisis= 0.248/1.060x100 = 23.39

• Tubo 2: 0.464

% hemólisis= 0.464/1.060x100 = 43.77

• Tubo 3:0.532

% hemólisis= 0.532/1.060x100 =50.18

• Tubo 4: 0.694

% hemólisis= 0.649/1.060x100 = 65.47

• Tubo 15: 0.964

% hemólisis= 0.964/1.060x100 = 90.94

• Tubo 16: 1.021

% hemólisis= 1.021/1.060x100 =96.32

• Tubo 17: 1.022

% hemólisis= 1.022/1.060x100 = 96.50

• Tubo 18: 1.060

% hemólisis= 1.060/1.060x100 = 100

Hoja de trabajo

1º.  ¿ Qué concentración de NaCl tiene el suero fisiológico?

- 9 gramos de cloruro sódico

2º ¿ En qué porcentaje se puede incrementar normalmente 

el volumen de los hematíes sin que éstos se rompan?

- 70%

3º¿Qué sustancia se emplea para anticoagular la sangre en 

esta prueba?

- Heparina

4º En esta prueba,¿cuál es la concentración salina menor a 

la que se preparan las soluciones?

- 0.5 g/l

5º En condiciones normales,¿ a qué concentración salina 

suele producirse una hemólisis del 50%?

- 5.5 g/l

6º ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la 

ROE ?

- esferocitosis eritrocitaria, eliptocitos u ovalocitos