Práctica 30: Sideremia

SIDEREMIA

Material:

• 4 tubos de ensayo
• Micropipeta
• Pipeta de cristal
• Espectofotómetro

Reactivos:

• Reactivo de trabajo
• R3
• Patron
• Agua destilada
• Muestra

Muestra:

• Suero

Procedimiento:

1. Cogemos 4 tubos de ensayo
2. Los rotulamos con blanco RT, patron, blanco muestra y muestra.
3. Añadimos en cada tubo 1 ml de reactivo de trabajo
4. Añadimos 1 gota de R3 en el tubo blanco RT, blanco muestra y muestra.
5. Añadimos 200 ul de agua destilada en el tubo blanco RT
6. Añadimos 200 ul de patron en el tubo patron
7. Añadimos 200 ul de muestra al tubo blanco muestra y muestra.
8. Dejar 10 min
9. Ir al espectofotómetro

Resultados:

(A) muestra - (A) blanco muestra

-----------------------------------------  x 100 

              (A) patron 
                                                                                                                1.581-1.577/0.105x100 = 3.8095 microgramos/ dl hierro

ABS patron: 0.105
ABS blanco muestra: 1.577
ABS Muestra: 1.581

Hoja de trabajo

1º. ¿Cuál es el reactivo cromógeno de esta técnica?

- FerroZine.


2º. ¿Por qué tenemos un tubo RT?

-Para calibrar el espectrofotómetro.


3º. ¿Qué muestras no son válidas?

-Las muestras hemolizadas.


4º. ¿En qué unidades se mide la sideremia?

- En microgramos/dl

Práctica 29: Hemoglobina

HEMOGLOBINA

Fundamento:

Transformar la hemoglobina en ciametahemoglobina

Material:

• 3 tubos de ensayo
• Micropipeta
• Pipeta de cristal
• Espectofotómetro

Reactivos:

• Reactivo de trabajo
• Calibrador

Muestra:

• Sangre venosa

Procedimiento:

1. Cogemos 3 tubos de ensayo
2. Los rotulamos con blanco, patron y muestra
3. Echamos 2.5 ml de reactivo de trabajo en los tres tubos
4. Añadimos 10 ul de calibrador en el tubo patron y en el tubo muestra
5. Añadimos 10 ul de muestra en el tubo muestra
6. Dejar 3 min
7. Ir al espectofotómetro

Resultados:

Hoja de trabajo

1. ¿ En qué se basan los métodos de la hemoglobina?

- en las propiedades fisico-químicas

2. ¿ Cuál es el métod recomendado por Comité Internacional para la estandarización de la hemoglobina?

- método colorimétrico de la ciametahemoglobina 

Práctica 28: Cálculo de los índices eritrocitarios

Cálculo de los índices eritrocitarios (RBC,HTO Y Hb)

Materiales.

Recuento RBC.

• Una pipeta de Thoma para glóbulos rojos.
• Un tubo de goma con boquilla.
• Una cámara de recuento.
• Un cubre.
• Un microscopio.
• Papel de filtro
• Tubo de ensayo.
• Gradilla.

HTO.

• Dos tubos capilares.
• Plastilina.
• Gasa.
• Una centrífuga de microhematocrito.
• Una regla milimetrada o un lector de microhematocrito.

Hb.

• 4 tubos de ensayo
• Gradilla.
• Micropipeta.
• Vaso de precipitado.
• pipeta de 5 ml o pipeta pasteur.
• Espectrofotómetro.

Reactivos.

Recuento RBC.

Líquido de dilución. El que vamos a utilizar, que es el más 

utilizado, es el de Hayem.

El líquido de Hayem se compone de:

• 2,5 g de sulfato sódico.
• 0,5 g de cloruro sódico.
• 0,25 g de cloruro mercurio.
• 100 ml de agua  destilada.

Para la limpieza de la pipeta de Thoma necesitaremos.

• Agua corriente.
• Agua destilada.
• Alcohol.

HTO.

• Ningunno

HB

• Hemoglobin 50x.

Ferrianuro de potasio 0,60 mmol/L

Cianuro de potasio  77 mmol/L

Dihidrógeno de fosfato sódico

Muestra:

• Sangre venosa

Procedimiento:

La primera práctica:

1. Llenamos de sangre un tubo de ensayo
2. Llenamos dos capilares 
3. Lo centrifugamos a 12000rpm durante 5 min.
4. Calculamos el porcentaje con una regla o un lector

La segunda práctica:

1. Cogemos la pipeta de Thoma y absorvemos la sangre hasta 1.
2. Después, lo introducimos en el otro tubo de ensayo y lo llenamos hasta la línea que tiene.
3. Quitamos el tubo de goma con cuidado y mezclamos suavemente.
4. Desechamos las tres gotas primeras
5. Cogemos el cubre y lo ponemos en el centro de la cámara humedeciendo los laterales con una gota de agua
6. Ponemos una gota entre la cámara y el cubre
7. Ponerlo en el microscopio con el aumento de 40 x y contar los hematíes que hay en 80 cuadrados pequeños del cuadro central.

La tercera práctica:

1. Cogemos 4 tubos de ensayo
2. Los rotulamos con blanco , patron, muestra 1 y muestra 2
3. Añadimos en los 4 tubos, 2.5 ml de reactivo de trabajo
4. Añadir 10 ul de calibrador en el tubo patron
5. Añadir 10 ul de muestra en el tubo muestra 1 y muestra 2
6. Dejar 3 min
7. Ir al espectofotómetro

Resultados:

HTO :

Primer capilar: 45%

Segundo capilar: 49%

RBC :

Primer recuento: 4400000 millones/ mm3

Segundo recuento: 3815000 millones/mm3

[Hb] :

Muestra 1 = 1,061

Muestra 2 =1,344

Práctica 27: Determinación del valor hematocrito mediante el micrométodo

Determinación del valor hematocrito mediante el micrométodo

Fundamento:

El HCT puede determinarse por métodos manuales o por métodos automáticos.

Los métodos manuales consisten en la centrifugación de la sangre, aplicando una fuerza de 2000 a 5000 g.

Los métodos automáticos pueden basarse en 2 principios:

• El cálculo matemático del HCT a partir de los valores de RBC y el volumen corpuscular medio
• El análisis de la sombra que produce la población eritrocitaria, al reflejarse en un campo oscuro.

Material:

• 2 capilares
• Plastilina
• Centrífuga
• Regla

Muestra: 

• Sangre venosa o capilar

Procedimiento:

1. Llenamos dos capilares con sangre
2. Los tapamos con plastilina
3. Los metemos en la centrífuga a 10500 rpm a 5 min.

Resultados:

• Hay dos tipos:Midiendo las columnas formadas en el interior de cada tubo con una regla y calculando el porcentaje.

       Si T------100%                       HCT = E x 100/ T

            E------ HCT    

• Mediante un lector de microhematocrito.

Hoja de trabajo

1º. ¿Qué significa la franja roja que tienen algunos capilares de microhematocrito?

- Que son capilares heparinizados

2º. ¿A qué fuerza relativa de centrifugación se centrifuga la sangre?

- De 12.000 a 15.000 g

3º.  Si la medida de la columna de eritrocitos es de 20 mm y la de la columna total es de 50 mm, ¿cuál es el valor del hematocrito?

- 50 -----100%         x = 20 x 100/50 = 40%

  20 ----- x

4º. Si con un capilar se obtiene un HCT de y con el otro uno de , ¿cómo debe ser la forma de actuar ante estos resultados?

- Se debe repetir la práctica

Práctica 26: Recuento de plaquetas con hemocitómetro

 Recuento de plaquetas con hemocitómetro

Fundamento:

Para el recuento en cámara de plaquetas, se diluye la sangre problema en un líquido y posteriormente se deposita la cámara de recuento donde se cuentan las células presentes en alguno de los cuadrados.

Material:

• Pipeta diluidora de Thoma de glóbulos rojos
• tubo de goma con boquilla
• Cámara de recuento
• Cubreobjetos
• Microscopio
• Placa de petri
• Papel de filtro

Muestra:

• Sangre capilar o venosa

Reactivos:

• Agua destilada
• Spinreact

Procedimiento:

1. Cogemos la pipeta de Thoma y la llenamos hasta 1
2. Lo metemos en el líquido de spinreact y aspiramos hasta 101
3. Quitamos el tubo de goma y agitamos durante 5 min.
4. Desechamos las 5 primeras gotas y después ponemos la sexta entre el cubre y la cámara.
5. En la placa de Petri, introducimos un papel de filtro mojado y a continuación metemos la cámara y la dejamos 15 min.
6. Observamos con el objetivo de 10x y luego con el de 40x 
7. Contamos cuantas hay en el cuadrado central.

Resultados:

PLT/mm3 = P x V x D = P x 1000

• PLT : número de plaquetas
• P: número de plaquetas contadas en el cuadrado central
• V: corrección de volumen
• D: corrección de dilución

Hoja de trabajo

1º. ¿Qué tipo de pipeta diluidora se utiliza en el recuento de plaquetas?

- La pipeta de Thoma

2º.¿Qué funciones desempeña el liquido de dilucion              empleado?

-Rompen los hematíes 

-Evita la agregación de las plaquetas entre si 

-Facilita la visualización de las plaquetas al hacerlas refrigerantes

3.¿Cuánto líquido de dilución se necesita para efectuar un 

ensayo?

-1 ml aproximadamente

4.¿Con qué se puede preparar una cámara húmeda?

- Con una placa de petri cerrada, en cuyo interior se deposita un papel de filtro con agua

5.¿Con qué objetivo se cuentan las plaquetas?

-40x

6.¿Cómo se aprecian los trombocitos en este recuento?

-Se aprecian como corpúsculos redondeados u ovalados de tamaño muy pequeño 

Resultados obtenidos

• Número de plaquetas contadas en un cuadrado grande: 740 
• Número de plaquetas por mm3 de sangre: 740.000.000 plaquetas/mm3

Práctica 25: Recuento de plaquetas en frotis sanguíneo

 Recuento de plaquetas en frotis sanguíneo

Material:

• Microscopio
• Papel
• Bolígrafo
• Portaobjetos

Muestra:

• Sangre problema

Reactivos:

• Líquido de inmersión
• Panóptico rápido

Procedimiento:

1. Hacemos un frotis sanguíneo
2. Lo teñimos con panóptico rápido
3. Echamos una gota de aceite de inmersión
4. Lo colocamos en el microscopio y lo observamos con el objetivo de 100x
5. Contamos el nº de plaquetas que hay en 10 campos.

Resultados:

Campo 1= 50

Campo 2= 60

Campo 3= 50

Campo 4= 40

Campo 5= 36

Campo 6= 35

Campo 7= 25

Campo 8= 40

Campo 9= 32

Campo 10= 40

        Total:408

PLT/mm3 = PLT/C x 20.000

PLT/mm3 = 408/10 x 20.000 = 816000 plaquetas/mm3

Hoja de trabajo

1º. En condiciones normales, ¿cuántas plaquetas por campo microscópico hay en una zona de un frotis sanguíneo donde los eritrocitos no están superpuestos?

 

- De 5 a 25 trombocitos por campo

Resultados obtenidos

• Número de plaquetas contadas en 10 campos microscópicos: 408 plaquetas
• Media del número de plaquetas contadas en 10 campos microscópicos: 40.8
• Número de plaquetas por mm3 de sangre: 816000 plaquetas/mm3

Práctica 24: Detección de crioglobulinas

 Detección de crioglobulinas

Fundamento:

La detección de crioglobulinas se basa en la exposición del suero problema a la acción de una temperatura baja.

Si el suero problema contiene crioglobulinas, éstas precipitan con el frío, y el precipitado formado adopta un aspecto de partículas blanquecinas.

Material:

• Pipeta Pasteur
• Tubo de ensayo
• Gradilla 
• Baño de agua
• Capilar no heparinizado
• Centrifugadora
• Regla.

Muestra:

Suero

Procedimiento:

1. Cogemos el tubo de ensayo con el tapón rojo
2. Lo centrifugamos a 3500 rpm a 15 min.
3. Retiramos el suero con la pipeta Pasteur y lo metemos en otro tubo
4. Con el capilar azul lo llenamos y lo tapamos con plastilina
5. Lo metemos en la centrifugadora durante 5 min a 10500 rpm
6. Medimos con la regla.

Resultados:

El resultado es negativo.

Hoja de trabajo

1º. ¿ A qué temperatura se debe someter el suero en una 

     detección de crioglobulinas?

-Se debe someter a unos 4-6ºC

2º. Si el precipitado no se reabsorbe con calor, ¿ de qué 

    sustancia está formado?

-De restos de fibrina.

3º. ¿ Cuántas cruces se le asigna a un suero que adquiere     

     un aspecto lechoso?

-Tres cruces.

4º. ¿ A qué concentración sérica suelen encontrarse las 

    crioglobulinas tipo I?

-Se encuentra en el suero a una alta concentración (> 5 

mg/ml )

5º. ¿ Qué manifestaciones clínicas puede producir una 

crioglobulinemia?

-Aumento de la viscosidad de la sangre.

-Precipitación de las crioglobulinas.

-Depósito de inmunocomplejos.

Práctica 23: Recuento de leucocitos

Recuento de leucocitos (WBC)

Fundamento:

En el recuento de leucocitos consiste en la determinación del número de leucocitos presentes en un volumen determinado de sangre.

Material:

• Pipeta diluidora de Thoma de glóbulos blancos

• Tubo de goma con boquilla.
• Cámara de recuento.

• Cubreobjetos.
• Microscopio.

Muestra:

Sangre capilar o venosa anticoagulada.

Reactivos:

• Turck

Procedimiento:

1. Cogemos la pipeta de Thoma y la llenamos hasta 1.
2. Luego la introducimos en el líquido de Turck y lo llenamos hasta 100.
3. Quitamos el tubo de goma y agitamos durante 2 o 3 min.
4. Desechamos las tres primeras gotas y ponemos la cuarta entre el cubre y el porta.
5. Observamos con el objetivo de 10x y contamos los leucocitos de los 4 cuadrados de las esquinas.

Resultados:

Total= 53 leucocitos.

Cuadro superior del extremo  de la izquierda.
2	5	2	2
1	1	5	2
2	2	7	2
1	9	6	4

Total=54 leucocitos.

Cuadro superior del extremo de la derecha.
2	5	2	2
4	5	3	5
4	3	2	3
4	4	3	3

Total= 58 leucocitos

Cuadro inferior del extremo  de la izquierda.
6	3	2	3
3	1	3	4
6	5	7	1
1	6	4	3

Total=51leucocitos.

Cuadro inferior  del extremo de la derecha.
4	0	5	1
1	4	3	4
3	1	4	5
6	2	6	2

WBC= L/4x10xD

• WBC: recuentos de leucocitos.
• L: leucocitos contados en 4 cuadrados grandes.
• D: factor de dilución.

WBC= 216/4x10x10= 5400 leucocitos/mm3 de sangre.

Hoja de trabajo

1º. ¿Cuál es el líquido de dilución en el WBC?

- Turck.

2º. ¿Para qué sirve el violeta de genciana que contiene el líquido de       dilución?

- Tiñe el núcleo para que se puedan ver mejor.

3º. ¿Con qué objetivo se pueden contar los leucocitos?

- Con el de 10x.

4º. Si la sangre se diluye a 1/10 y se cuentan 100 leucocitos en 2 cuadrados grandes periféricos, ¿cuál es el WBC obtenido?

- WBC= 100/2x10x10= 5000 leucocitos/mm3 de sangre.

Práctica 22: Detección del índice de lobularidad

 Detección del índice de lobularidad (IL)

Material:

• Microscopio
• Bolígrafo
• Papel

Muestra:

Extensión sanguínea fina.

Reactivos:

• Líquido de inmersión.
• Panóptico rápido.

Técnica:

1. Hacer una extensión sanguínea
2. Lo teñimos con panóptico rápido.
3. Echamos una gota de aceite de inmersión  
4. Observar en el microscopio con el objetivo de 100x.
5. Contar las lobulaciones de los neutrófilos.
6. Clasificarlos según Arneth.

Resultado:

Aplicamos la siguiente fórmula: IL= NL/NN

• IL: Índice de lobulidad.
• NL: Nº de lóbulos contados
• NN: Nº de neutrófilos observados 

Hoja de trabajo

1º. ¿Cuántos tipos de neutrófilos hay según Arneth?

- Hay 5 tipos:

• Tipo I: neutrófilos con un núcleo no segmentado, es decir, sin lobulaciones.
• Tipo II: neutrófilos con un núcleo dividido una vez,es decir, con 2 lóbulos.
• Tipo III: neutrófilos con un núcleo dividido 2 veces, es decir, con 3 lóbulos.
• Tipo IV: neutrófilos con un núcleo dividido 3 veces, es decir, con 4 lóbulos.
• Tipo V: neutrófilos con un núcleo dividido 4 veces, es decir, con 5 lóbulos.

2º. ¿Qué tipo de desviación hay si el IL es igual a 2.5?

- Ninguna, ya que el IL es normal.

3º. ¿De qué enfermedades es típica la desviación a la izquierda con neutrófilos?

- De infecciones agudas.