Práctica 47: Determinación del fenotipo y genotipo del sistema Rh

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh

Fundamento:

Podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.

La exixtencia o no de estos antígenos en la superficie de los hematíes se detecta por una reacción de aglutinación. Los resultados de estas reacciones se trasladan a una tabla donde podemos ver los posibles genotipos correspondientes.

Material:

• Tubos de centífuga.
• Centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla.
• Vaso de precipitado.

Muestra: 

• Suspensión de hematíes lavados al 5% en solución salina fisiológica.

Reactivos:

• Suero anti-D
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-c
• Suero anti-e
• Solución salina fisiológico.

Procedimiento:

1. Una vez que tenemos los hematíes lavados y la suspensión de hematíes al 5%, rotulamos 5 tubos de centrífuga con las letras D,C,E,c y e.
2. En cada tubo añadimos una gota del antisuero correspondiente y una gota de la suspensión de hematíes al 5%.
3. Centrifugamos todos los tubos a 1000 rpm durante 1 min.
4. Leemos los resultados.

Resultados:

Golpeamos suavemente con el pulpejo de los dedos medio y anular en el fondo de los tubos para despegar el sedimento hemático.

El resultado positivo es la presencia de aglutinación y se observa con la presencia de grumos rojos sobre un líquido claro.

La ausencia de aglutinación es un resultado negativo y se observa como la suspensión homogénea de los hematíes en un líquido rojizo.

Tubo	Aglutinación
D	-
C	+
E	+
c	+
e	+

Un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tubo. El resultado negativo indica lo contrario.

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipo y genotipo del sistema Rh.

Grupo Rh	RESULTADOS					GENOTIPOS POSIBLES (según nomenclatura de Fisher-Race)
	D	C	E	c	e
-	-	-	-	+	+	dce/ dce
		+	-	+	+	dCe/dce
				-	+	dCe/ dCe
		-	+	+	+	dcE/dce
				+	-	dcE/dcE
		+	+	+	+	dCe/dcE                     dCE/dce
				-	+	dCE/dCe
				+	-	dCE/dcE
				-	-	dCE/dCE
+	+	-	-	+	+	Dce/dce                      Dce/dce
		+	-	+	+	DCe/dce          DCe/Dce        Dce/dCe
				-	+	DCe/DCe                                 DCe/dCe
		-	+	+	+	DcE/dce            DcE/Dce        Dce/dcE
				+	-	DcE/DcE                                     DcE/dce
		+	+	+	+	DCe/DcE          DCe/dcE            DcE/dCe
						DCE/dce          DCE/Dce           DCe/dcE
				-	+	DCE/DCe        DCE/dCe             DCe/dCE
				+	-	DCE/DcE        DCE/dcE             DcE/dCE
				-	-	DCE/DCE                                   DCE/dCE

Hoja de trabajo

1. ¿Qué antisueros se utilizan en esta técnica?

- Anti-C, anti-D, anti-E, anti-c, anti-e

2. ¿Por qué no existe suero anti-d?

- Porque no existe un antígeno d

3. ¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos?

- El fenotipo

4. Si la sangre es Rh +, ¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh?

- No porque existen varios genotipos posibles

5. Si los resultados obtenidos son: D-, C-,E+, c+ y e-; ¿cuál es el genotipo posible de esta sangre?

- dcE/dcE

Práctica 46: Determinación del grupo Rh en tubo

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO

Fundamento:
Al igual que en la prueba en portaobjetos, intentamos poner de manifiesto la presencia del antígeno D en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a un suero anti-D.

Material:

• Tubos de centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.
• Pipeta Pasteur.
• Centrífuga.

Reactivos

• Suero anti-D.
• Albúmina bovina al 30%
• Solución salina

Muestra:

• Hematíes problema preparados en suspensión al 5%

Antes de proceder a suspender los hematíes debemos lavarlos tres veces en solución salina. Para ello cogemos 0.5 ml de sangre problema y 0.5 ml de solución salina y lo metemos en la centrífuga a 2000 rpm durante 4 min. Sacamos el sobrenadante y lo repetimos dos veces más.

En otro tubo echamos 5 gotas de los hematíes lavados con 5 ml de solución salina, mezclamos y tenemos hematíes al 5%.

Procedimiento:

1. Rotulamos dos tubos con la letra D y A.
2. En el tubo D añadimos una gota de suero anti- D y el tubo A ponemos una gota de albúmina.
3. En cada tubo, añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5%. Agitamos suavemente.
4. Centrifugamos a 1000 rpm durante 1 min.
5. Leemos los resultados.

Resultados:

Con el pulpejo de los dedos medio y anular golpeamos suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático.

Si hay aglutinación positiva, se forman grumos rojos en un líquido claro.

Si no hay aglutinación, se resuspenden homogéneamente los hematíes.

E tubo con albúmina es un control negativo y debe dar siempre ausencia de aglutinación. En caso de no ser así, el resultado de la prueba no es válido.

Si el tubo D presenta aglutinación y el tubo A no, decimos que el paciente es Rh positivo.
Si no se produce aglutinación en ninguno de los dos tubos, procedemos a incubarlos a 37ºC durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1000 rpm durante 1 min y observamos si existe o no aglutinación.

En saco de persistir la negatividad comprobaremos que el paciente no posee un Du (D débil) mediante una prueba de coombs indirecta.
Si después de todos estos pasos el resultado es la no aglutinación, diremos al paciente que es Rh negativo.

Hoja de trabajo

1. ¿Por qué utilizamos el control de albúmina?

- La albúmina es un control negativo y debe dar ausencia de aglutinación. En caso de no ser así, el resultado no es válido.

2. ¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D?

- Que debemos incurbarlos a 37ºC durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

3. ¿ Qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto?

- Que no tenga un Du

4. ¿Cómo se prepara la muestra problema?

- Lavando los hematíes y posteriormente una suspensión de hematíes al 5%.

Práctica 45: Determinación del grupo Rh en porta

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA

Fundamento:

Esta técnica se basa en la detección del antígeno D sobre la superficie de los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-D

En el caso de que los hematíes contengan al antígenos D se producirá una aglutinación que puede observarse a simple vista.

Material:

• Portaobjetos
• Lanceta
• Gasas
• Pipeta Pasteur
• Rotulador de vidrio
• Palillos agitadores
• Visualizador luminoso

Muestra:

• Sangre total anticoagulada.

Reactivos:

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30%
• Alcohol

Procedimiento:

1. Dividir el porta en dos partes con el rotulador de vidrio y marcar una con la letra S (suero) y otra con la letra A (albúmina)
2. En el lado S colocamos dos gotas del suero anti-D y en el lado A ponemos dos gotas de albúmina.
3. Ponemos una gota de sangre a cada lado que anteriormente nos hemos pinchado con la lanceta.
4. Removemos con los palillos y colocamos el porta sobre el visualizador previamente calentado y lo movemos para favorecer la mezcla de sangre y reactivo.

Resultados:

Esperamos dos min antes de dar el resultado de la prueba.

Aglutinación positiva: Aparece grumos rojos sobre un fondo claro. No debe confundirse con pequeños coágulos de fibrina en la muestra.

Aglutinación negativa: La mezcla da lugar a una suspensión homogénea de los hematíes.

La mezcla de sangre con albúmina debe ser siempre aglutinación negativa. En caso de no ser así, no podemos informar del resultado de la prueba.

Los resultados se interpretan según el siguiente cuadro:

Sección S	Sección A	Interpretación
+	-	Rh positivo
-	-	Rh negativo
+	+	¿?

+: Aglutinación positiva.

-: Aglutinación negativa.

¿?: No se puede interpretar

Hoja de trabajo

1. ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?

- Sangre capilar

2. ¿Para qué se utiliza el visualizador?

- Para favorecer la mezcla de sangre y reactivos.

3. ¿Qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones?

- Pequeños coágulos de fibrina.

4. ¿Qué ocurre si aglutina la sección A?

- Que no se puede dar el resultado porque al mezclar la sangre con albúmina debe dar una aglutinación negativa.

Una vez que hemos hecho la práctica, hemos anotados los Rh de la clase: 

Rh+: 18
Rh-: 2

Práctica 44: Determinación sérica del grupo AB0

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO AB0

Fundamento:

El suero de un individuo sólo debe contener anticuerpos frente a los antígenos que no están presentes en sus propios hematíes. Por ello, al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B, sólo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes.

Material:

• Tubos de centrífuga.
• Pipeta Pasteur.
• Baño de agua.
• Centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla. 
• Vaso de precipitado.

Muestra:

• Suero obtenido mediante coagulación de la sangre en baño de agua a 37ºC durante 20 minutos. Posteriormente centrifugamos durante 10 minutos a 30000 rpm y extraemos el sobrenadante con una pipeta Pasteur.

Reactivos:

• Hematíes del grupo A1
• Hematíes del grupo A2
• Hematíes del grupo B
• Hematíes del grupo 0
• Hematíes de la sangre problema.

Procedimiento:

1. Incubamos el suero o plasma en el baño de agua a 56ºC durante 10 minutos.
2. Lavamos tres veces los hematíes de la sangra problema con solución salina, después hacemos una suspensión de hematíes al 5%.
3. Rotulamos 5 tubos de centrifuga con la letra A1, A2, B, 0 y C.
4. Añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado.
5. Depositamos una gota de suspensión de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotulado. En el tubo C añadimos una gota de la suspensión de los hematíes propios de la sangre problema, ya que nos servirá de control negativo.
6. Agitamos suavemente y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Resultados:

Golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos para despegar el sedimento hemático.

Si aparecen grumos rojos flotando en un líquido claro indica que existe aglutinación. en caso contrario, los hematíes se resuspenden homogéneamente dando lugar a un líquido de color rojizo.

	Aglutinación	No aglutinación
Tubo A1		no
Tubo A2		no
Tubo B		no
Tubo 0		no
Tubo C		no

Hemos repetido la prueba dos veces y no se ha apreciado aglutinación en ningún tubo.

El grupo eritrocitario que se asignará, atendiendo a los resultados obtenidos, se puede ver en el siguiente cuadro:

Tubo A1	Tubo A2	Tubo B	Tubo 0	Tubo C	Ac presentes en el suero	Grupo eritrocitario
-	-	+	-	-	Anti-B	A1
- o  +*	-	+	-	-	Anti-B y anti-A1*	A2
+	+	-	-	-	Anti-A	B
+	+	+	-	-	Anti-A y anti-B	0
-	-	-	-	-	Ninguno	A1B
- o +”	-	-	-	-	Ninguno o anti-A1	A2B
+	+	+	+	+	Autoanticuerpos	Ininterpretable

+: aglutinación.

-: no aglutinación.

*: este anti-A1 se encuentra sólo en un 2% de los individuos A2.

ó: este resultado se observa sólo en el 25% de los individuoos A2B.

Es difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso de los recién nacido, ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados aún. Tambi´wn encontramos dificultades en los pacientes con agammaglobulinemia ua que carecen de anticuerpos, y en aquellos que poseen otros anticuerpos específicos o inespecíficos capaces de reaccionar con los antígenos del grupo AB0.

Hoja de trabajo

1. ¿Qué son los hematíes tipados?

- Hematíes que sabemos de que grupo son.

2. ¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente?

- al 5%

3. ¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica?

- Suero obtenido mediante la coagulación de la sangre

4. ¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?

- Se debería repetir la prueba ya que el tubo C debe dar negativo