Práctica 51. PCR

PCR

Material

• Tubos de eppendorf
• Micropipeta de 50 ml
• Centrífuga para eppendorf

• Pipetas graduadas de 5 ml y 2 ml.
• Gradilla.
• Vaso de precipitado.
• Tubos de ensayo.
• Máquina para calentar eppendorf

Reactivos

• Matriz Instagene.
• Suero salino al 0.9%.
• Agua destilada.

Muestra

• Células de la mucosa bucal.

Procedimiento

1º parte

1. Cogemos un tubo de ensayo y le añadimos 3 ml de solución salina.
2. Con un bastoncillo nos frotamos las paredes de la mucosa y lo mezclamos con los 3 ml de solución salina.
3. Echo 1.4 ml del tubo de ensayo en un tubo eppendorf y lo centrifugamos a 8000 rpm 5 minutos.
4. Quitamos el sobrenadante y le añadimos 70 ul de reactivo matriz instagene y lo mezclamos.
5. Incubamos 10 minutos a 100ºC y lo enfriamos a temperatura ambiente.
6. Centrifugamos a 1300 rpm durante 30 segundos.
7. Cogemos 10 ul de ese eppendorf y lo echamos en otro tubo nuevo de eppendorf.
8. Rotulamos el eppendorf y lo congelamos.

2º parte

1. Cogemos el eppendorf y le añadimos 18.5 ul de agua destilada + 2 ul de oligo 1 + 2 ul oligo 2 + 2.5 ul ADN.
2. Y le damos un golpe de centrífuga.

3º parte

1. Preparar el gel de agarosa

• Cogemos u vidrio de reloj y pesamos 1.5 g de agarosa
• En una probeta echamos 10 ml de tampón TAE y enraso hasta 100 ml con agua destilada.
• Después lo paso a un vaso de precipitado y lo metemos en el microondas hasta que se mezcle bien y no queden hebras.
• Lo dejamos enfriar y le añadimos 5 ul colorante Redsafe, lo removemos con una varilla y lo echamos en una cubeta de electroforesis y le pongo los peines.
• Cuando se solidifique el gel lo retiramos y lo colocamos en la cubeta grande de electroforesis.

    2. Preparar un tampón 1xTAE

• En una probeta de 1000 ml, echamos 100 ml de tampón TAE y 900 ml de agua destilada.
• Agitamos y ese líquido lo echamos en la cubeta de electroforesis hasta que quede cubierto el gel de agarosa.

    3.  Preparar un tampón de carga con azul de metileno

• 900 ul de glicerol + 25 mg de azul de metileno, enrasamos hasta llegar a 10 ml con agua destilada.

Cuando ya tengamos todas las soluciones seguimos con la práctica

1. A continuación en el pocillo 1 y 16 echamos 10 ul de azul de metileno; en el pocillo 1 y 16  de la fila del medio echamos 10 ul de tampón comassie.
2. Sacamos los eppendorf del congelador y lo dejamos a temperatura ambiente.
3. Cogemos otros dos eppendorf y los rotulamos con a y b y le añadimos al a 5 ul de tampón de carga azul de metileno + 5 ul de ADN; en el otro echamos 5 ul de comassie + 5 ul de ADN.
4. Con una micropipeta cogemos todo del eppendorf a y lo echamos en el pocillo donde está el cátodo negativo (nº 15) y el b lo echamos en el pocillo 15 pero en la fila del medio.
5. Lo cerramos y lo conectamos 120 voltios durante 30 minutos.
6. Cuando termina la electroforesis se visualiza los fragmentos de ADN con una luz ultravioleta.

Práctica 50. Determinación rápida de hemoglobina

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE HEMOGLOBINA

Fundamento

Para determinar la concentración de hemoglobina justo antes de una donación.

Esta determinación rápida de Hb se basa en el hecho de que una sangre con una concentración de Hb superior a la permitida, para poder efectuar una donación, tiene una densidad mayor a la de una solución de sulfato de cobre previamente preparada. 

Para donantes varones se debe preparar una solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1.054 g/cm3, ya que a través de esta solución cae libremente una gota de sangre con Hb a una concentración superior a  g/cm3.

Para mujeres donantes se debe preparar una solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1.052 g/cm3, ya que a través de esta disolución cae libremente una gota de sangre con Hb a una concentración superior a 12 g/cm3.

Material

• Material de extracción de sangre capilar.
• Vaso de precipitado de 50 ml.

Reactivos

• Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1.052 g/dl. Se prepara de la siguiente forma:

1. Disolver 17 g de sulfato de cobre en 100 ml de agua destilada.

  La densidad de la solución de sulfato de cobre varía con la temperatura. Así pues, por ejemplo, para obtener la misma densidad a una temperatura ambiente de 22ºC, se han de añadir 0.74 ml más de agua destilada.

2. Mezclar 51 ml de la solución madre con 49 ml de agua destilada.

Muestra

• Sangra capilar.

Procedimiento

1. Echar el sulfato de cobre en un vaso de precipitado de 50 ml.
2. Dejar caer una gota de sangre en la disolución..

Resultados

Si la gota de sangre es más densa que la solución de sulfato de cobre, cae libremente a través de ella.

Pero si la gota de sangre es menos densa que la solución de sulfato de cobre, no cae al fondo del vaso de precipitados que contiene esta disolución.

Hoja de trabajo

1. ¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación?

- 12.5 g/dl

2. ¿Con qué otra disolución comparamos la densidad de la sangre?

- Sulfato de cobre de 1.052g/dl

Práctica 49. Prueba cruzada mayor

PRUEBA CRUZADA MAYOR

Fundamento

Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último frente al suero antiglobulina de Coombs.

Con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

Material

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Baño de agua.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla.
• Reloj.
• Vaso de precipitado.

Reactivos

• Solución salina.
• Albúmina bovina al 30%.
• Suero antiglobulina de Coombs.

Muestra

• Suero del receptor, obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis.
• Hematíes previamente lavados tres veces en solución salina y resuspendidos al 2-5%.

Procedimiento

1. En un tubo de hemólisis depositamos 1 gota de la suspensión de hematíes y 2 gotas del suero del recptor-
2. Mezclamos suavemente y dejamos a temepratura ambiente durante 2-3 minutos.
3. Centrifugamos a 3500 rpm durante 30 segundos.
4. Leemos el resultado obtenido en medio salino.
5. Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina bovina.
6. Mezclamos e incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
7. Leemos el resultado obtenido en medio albuminoso.
8. Lavamos tres veces los hematíes con solución salina para eliminar losa nticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos. Retirar el sobrenadante del último lavado.
9. Añadimos al tubo 1 gota de suero antiglobulina humana de Coombs y mezclamos.
10. Centrifugamos a 1000 rpm durante 2 minutos.
11. Leemos los resultados.

Resultados

La lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botón hemático después de cada una de las centrifugación.

En caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40x

La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles y por tanto, la transfusión es posible.

La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad.

Hoja de trabajo

1. ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor?

- Suero del receptor y hematíes del donante.

2. ¿Cuando se debe realizar la prueba cruzada menor?

- Cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligrosa.

3. ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoso?

- Para detectar todos los anticuerpos posibles.

4. ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs?

- Anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

Práctica 48. Determinación de un Du

DETERMINACIÓN DE UN Du

Fundamento

El Du es un antígeno D débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normles de determinación del Rh.
Por ello debemos sensibilizar previamente los hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos anti-D, posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs. Si existe el antígeno Du en la superficie de los eritrocitos, se producirá la unión de los anticuerpos anti-D a sus receptores de membrana y en la segunda fase darán lugar a la aglutinación en presencia del suero antiglobulina humana.
Es una prueba de Coombs indirecta.

Material

• Tubos de centrífuga.
• Centrífuga.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla.
• Baño de agua.
• Reloj.

Reactivos

• Suero anti-D humano.
• Suero antiglobulina humana
• Solución salina.

Muestra

• Hematíes de la sangre problema previamente lavados tres veces en solución salina y suspendidos al 5%.

Procedimiento

1. En un tubo añadimos 1 gota de suero anti-D y 1 gota de la suspensión de hematíes al 5%.
2. Mezclamos suavemente e incubamos a 37ºC durante 30-45 minutos.
3. Después lavamos los hematíes en solución salina tres veces y quitamos todo el sobrenadante en el último lavado.
4. Añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs y mezclamos suavemente.
5. Centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.
6. Leemos los resultados.

Resultados

Observamos la aparición o no de aglutinación mediante golpes suaves en el fondo del tubo. 

Si existe aglutinación, el resultado es positivo. Indica que en la membrana de los hematíes hay un antígeno Du, y se clasifica la sangre como Rh positivo variante Du.

En el caso de no existir aglutinación se clasifica la sangre como Rh negativo.

Para evitar falsos positivos debido a una sensibilización previa de los hematíes in vivo, debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema. Esto nos servirá como control negativo.

Hoja de trabajo

1. ¿Qué contiene el suero de Coombs?

- Anticuerpos antiglobulina humana

2. ¿Qué se detecta con la prueba directa?

- Anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo

3. ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?

- Anticuerpos incompletos libres en el suero

4. ¿Qué buscamos en la sangre del paciente?

- Si el paciente tiene un antígeno Du

5. ¿Qué ocurre si el control es positivo?

- Debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema.

Práctica 47: Determinación del fenotipo y genotipo del sistema Rh

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh

Fundamento:

Podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.

La exixtencia o no de estos antígenos en la superficie de los hematíes se detecta por una reacción de aglutinación. Los resultados de estas reacciones se trasladan a una tabla donde podemos ver los posibles genotipos correspondientes.

Material:

• Tubos de centífuga.
• Centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla.
• Vaso de precipitado.

Muestra: 

• Suspensión de hematíes lavados al 5% en solución salina fisiológica.

Reactivos:

• Suero anti-D
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-c
• Suero anti-e
• Solución salina fisiológico.

Procedimiento:

1. Una vez que tenemos los hematíes lavados y la suspensión de hematíes al 5%, rotulamos 5 tubos de centrífuga con las letras D,C,E,c y e.
2. En cada tubo añadimos una gota del antisuero correspondiente y una gota de la suspensión de hematíes al 5%.
3. Centrifugamos todos los tubos a 1000 rpm durante 1 min.
4. Leemos los resultados.

Resultados:

Golpeamos suavemente con el pulpejo de los dedos medio y anular en el fondo de los tubos para despegar el sedimento hemático.

El resultado positivo es la presencia de aglutinación y se observa con la presencia de grumos rojos sobre un líquido claro.

La ausencia de aglutinación es un resultado negativo y se observa como la suspensión homogénea de los hematíes en un líquido rojizo.

Tubo	Aglutinación
D	-
C	+
E	+
c	+
e	+

Un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tubo. El resultado negativo indica lo contrario.

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipo y genotipo del sistema Rh.

Grupo Rh	RESULTADOS					GENOTIPOS POSIBLES (según nomenclatura de Fisher-Race)
	D	C	E	c	e
-	-	-	-	+	+	dce/ dce
		+	-	+	+	dCe/dce
				-	+	dCe/ dCe
		-	+	+	+	dcE/dce
				+	-	dcE/dcE
		+	+	+	+	dCe/dcE                     dCE/dce
				-	+	dCE/dCe
				+	-	dCE/dcE
				-	-	dCE/dCE
+	+	-	-	+	+	Dce/dce                      Dce/dce
		+	-	+	+	DCe/dce          DCe/Dce        Dce/dCe
				-	+	DCe/DCe                                 DCe/dCe
		-	+	+	+	DcE/dce            DcE/Dce        Dce/dcE
				+	-	DcE/DcE                                     DcE/dce
		+	+	+	+	DCe/DcE          DCe/dcE            DcE/dCe
						DCE/dce          DCE/Dce           DCe/dcE
				-	+	DCE/DCe        DCE/dCe             DCe/dCE
				+	-	DCE/DcE        DCE/dcE             DcE/dCE
				-	-	DCE/DCE                                   DCE/dCE

Hoja de trabajo

1. ¿Qué antisueros se utilizan en esta técnica?

- Anti-C, anti-D, anti-E, anti-c, anti-e

2. ¿Por qué no existe suero anti-d?

- Porque no existe un antígeno d

3. ¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos?

- El fenotipo

4. Si la sangre es Rh +, ¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh?

- No porque existen varios genotipos posibles

5. Si los resultados obtenidos son: D-, C-,E+, c+ y e-; ¿cuál es el genotipo posible de esta sangre?

- dcE/dcE

Práctica 46: Determinación del grupo Rh en tubo

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO

Fundamento:
Al igual que en la prueba en portaobjetos, intentamos poner de manifiesto la presencia del antígeno D en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a un suero anti-D.

Material:

• Tubos de centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.
• Pipeta Pasteur.
• Centrífuga.

Reactivos

• Suero anti-D.
• Albúmina bovina al 30%
• Solución salina

Muestra:

• Hematíes problema preparados en suspensión al 5%

Antes de proceder a suspender los hematíes debemos lavarlos tres veces en solución salina. Para ello cogemos 0.5 ml de sangre problema y 0.5 ml de solución salina y lo metemos en la centrífuga a 2000 rpm durante 4 min. Sacamos el sobrenadante y lo repetimos dos veces más.

En otro tubo echamos 5 gotas de los hematíes lavados con 5 ml de solución salina, mezclamos y tenemos hematíes al 5%.

Procedimiento:

1. Rotulamos dos tubos con la letra D y A.
2. En el tubo D añadimos una gota de suero anti- D y el tubo A ponemos una gota de albúmina.
3. En cada tubo, añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5%. Agitamos suavemente.
4. Centrifugamos a 1000 rpm durante 1 min.
5. Leemos los resultados.

Resultados:

Con el pulpejo de los dedos medio y anular golpeamos suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático.

Si hay aglutinación positiva, se forman grumos rojos en un líquido claro.

Si no hay aglutinación, se resuspenden homogéneamente los hematíes.

E tubo con albúmina es un control negativo y debe dar siempre ausencia de aglutinación. En caso de no ser así, el resultado de la prueba no es válido.

Si el tubo D presenta aglutinación y el tubo A no, decimos que el paciente es Rh positivo.
Si no se produce aglutinación en ninguno de los dos tubos, procedemos a incubarlos a 37ºC durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1000 rpm durante 1 min y observamos si existe o no aglutinación.

En saco de persistir la negatividad comprobaremos que el paciente no posee un Du (D débil) mediante una prueba de coombs indirecta.
Si después de todos estos pasos el resultado es la no aglutinación, diremos al paciente que es Rh negativo.

Hoja de trabajo

1. ¿Por qué utilizamos el control de albúmina?

- La albúmina es un control negativo y debe dar ausencia de aglutinación. En caso de no ser así, el resultado no es válido.

2. ¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D?

- Que debemos incurbarlos a 37ºC durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

3. ¿ Qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto?

- Que no tenga un Du

4. ¿Cómo se prepara la muestra problema?

- Lavando los hematíes y posteriormente una suspensión de hematíes al 5%.

Práctica 45: Determinación del grupo Rh en porta

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA

Fundamento:

Esta técnica se basa en la detección del antígeno D sobre la superficie de los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-D

En el caso de que los hematíes contengan al antígenos D se producirá una aglutinación que puede observarse a simple vista.

Material:

• Portaobjetos
• Lanceta
• Gasas
• Pipeta Pasteur
• Rotulador de vidrio
• Palillos agitadores
• Visualizador luminoso

Muestra:

• Sangre total anticoagulada.

Reactivos:

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30%
• Alcohol

Procedimiento:

1. Dividir el porta en dos partes con el rotulador de vidrio y marcar una con la letra S (suero) y otra con la letra A (albúmina)
2. En el lado S colocamos dos gotas del suero anti-D y en el lado A ponemos dos gotas de albúmina.
3. Ponemos una gota de sangre a cada lado que anteriormente nos hemos pinchado con la lanceta.
4. Removemos con los palillos y colocamos el porta sobre el visualizador previamente calentado y lo movemos para favorecer la mezcla de sangre y reactivo.

Resultados:

Esperamos dos min antes de dar el resultado de la prueba.

Aglutinación positiva: Aparece grumos rojos sobre un fondo claro. No debe confundirse con pequeños coágulos de fibrina en la muestra.

Aglutinación negativa: La mezcla da lugar a una suspensión homogénea de los hematíes.

La mezcla de sangre con albúmina debe ser siempre aglutinación negativa. En caso de no ser así, no podemos informar del resultado de la prueba.

Los resultados se interpretan según el siguiente cuadro:

Sección S	Sección A	Interpretación
+	-	Rh positivo
-	-	Rh negativo
+	+	¿?

+: Aglutinación positiva.

-: Aglutinación negativa.

¿?: No se puede interpretar

Hoja de trabajo

1. ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?

- Sangre capilar

2. ¿Para qué se utiliza el visualizador?

- Para favorecer la mezcla de sangre y reactivos.

3. ¿Qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones?

- Pequeños coágulos de fibrina.

4. ¿Qué ocurre si aglutina la sección A?

- Que no se puede dar el resultado porque al mezclar la sangre con albúmina debe dar una aglutinación negativa.

Una vez que hemos hecho la práctica, hemos anotados los Rh de la clase: 

Rh+: 18
Rh-: 2