Práctica 51. PCR

PCR

Material

• Tubos de eppendorf
• Micropipeta de 50 ml
• Centrífuga para eppendorf

• Pipetas graduadas de 5 ml y 2 ml.
• Gradilla.
• Vaso de precipitado.
• Tubos de ensayo.
• Máquina para calentar eppendorf

Reactivos

• Matriz Instagene.
• Suero salino al 0.9%.
• Agua destilada.

Muestra

• Células de la mucosa bucal.

Procedimiento

1º parte

1. Cogemos un tubo de ensayo y le añadimos 3 ml de solución salina.
2. Con un bastoncillo nos frotamos las paredes de la mucosa y lo mezclamos con los 3 ml de solución salina.
3. Echo 1.4 ml del tubo de ensayo en un tubo eppendorf y lo centrifugamos a 8000 rpm 5 minutos.
4. Quitamos el sobrenadante y le añadimos 70 ul de reactivo matriz instagene y lo mezclamos.
5. Incubamos 10 minutos a 100ºC y lo enfriamos a temperatura ambiente.
6. Centrifugamos a 1300 rpm durante 30 segundos.
7. Cogemos 10 ul de ese eppendorf y lo echamos en otro tubo nuevo de eppendorf.
8. Rotulamos el eppendorf y lo congelamos.

2º parte

1. Cogemos el eppendorf y le añadimos 18.5 ul de agua destilada + 2 ul de oligo 1 + 2 ul oligo 2 + 2.5 ul ADN.
2. Y le damos un golpe de centrífuga.

3º parte

1. Preparar el gel de agarosa

• Cogemos u vidrio de reloj y pesamos 1.5 g de agarosa
• En una probeta echamos 10 ml de tampón TAE y enraso hasta 100 ml con agua destilada.
• Después lo paso a un vaso de precipitado y lo metemos en el microondas hasta que se mezcle bien y no queden hebras.
• Lo dejamos enfriar y le añadimos 5 ul colorante Redsafe, lo removemos con una varilla y lo echamos en una cubeta de electroforesis y le pongo los peines.
• Cuando se solidifique el gel lo retiramos y lo colocamos en la cubeta grande de electroforesis.

    2. Preparar un tampón 1xTAE

• En una probeta de 1000 ml, echamos 100 ml de tampón TAE y 900 ml de agua destilada.
• Agitamos y ese líquido lo echamos en la cubeta de electroforesis hasta que quede cubierto el gel de agarosa.

    3.  Preparar un tampón de carga con azul de metileno

• 900 ul de glicerol + 25 mg de azul de metileno, enrasamos hasta llegar a 10 ml con agua destilada.

Cuando ya tengamos todas las soluciones seguimos con la práctica

1. A continuación en el pocillo 1 y 16 echamos 10 ul de azul de metileno; en el pocillo 1 y 16  de la fila del medio echamos 10 ul de tampón comassie.
2. Sacamos los eppendorf del congelador y lo dejamos a temperatura ambiente.
3. Cogemos otros dos eppendorf y los rotulamos con a y b y le añadimos al a 5 ul de tampón de carga azul de metileno + 5 ul de ADN; en el otro echamos 5 ul de comassie + 5 ul de ADN.
4. Con una micropipeta cogemos todo del eppendorf a y lo echamos en el pocillo donde está el cátodo negativo (nº 15) y el b lo echamos en el pocillo 15 pero en la fila del medio.
5. Lo cerramos y lo conectamos 120 voltios durante 30 minutos.
6. Cuando termina la electroforesis se visualiza los fragmentos de ADN con una luz ultravioleta.