Práctica 51. PCR

PCR

Material

• Tubos de eppendorf
• Micropipeta de 50 ml
• Centrífuga para eppendorf

• Pipetas graduadas de 5 ml y 2 ml.
• Gradilla.
• Vaso de precipitado.
• Tubos de ensayo.
• Máquina para calentar eppendorf

Reactivos

• Matriz Instagene.
• Suero salino al 0.9%.
• Agua destilada.

Muestra

• Células de la mucosa bucal.

Procedimiento

1º parte

1. Cogemos un tubo de ensayo y le añadimos 3 ml de solución salina.
2. Con un bastoncillo nos frotamos las paredes de la mucosa y lo mezclamos con los 3 ml de solución salina.
3. Echo 1.4 ml del tubo de ensayo en un tubo eppendorf y lo centrifugamos a 8000 rpm 5 minutos.
4. Quitamos el sobrenadante y le añadimos 70 ul de reactivo matriz instagene y lo mezclamos.
5. Incubamos 10 minutos a 100ºC y lo enfriamos a temperatura ambiente.
6. Centrifugamos a 1300 rpm durante 30 segundos.
7. Cogemos 10 ul de ese eppendorf y lo echamos en otro tubo nuevo de eppendorf.
8. Rotulamos el eppendorf y lo congelamos.

2º parte

1. Cogemos el eppendorf y le añadimos 18.5 ul de agua destilada + 2 ul de oligo 1 + 2 ul oligo 2 + 2.5 ul ADN.
2. Y le damos un golpe de centrífuga.

3º parte

1. Preparar el gel de agarosa

• Cogemos u vidrio de reloj y pesamos 1.5 g de agarosa
• En una probeta echamos 10 ml de tampón TAE y enraso hasta 100 ml con agua destilada.
• Después lo paso a un vaso de precipitado y lo metemos en el microondas hasta que se mezcle bien y no queden hebras.
• Lo dejamos enfriar y le añadimos 5 ul colorante Redsafe, lo removemos con una varilla y lo echamos en una cubeta de electroforesis y le pongo los peines.
• Cuando se solidifique el gel lo retiramos y lo colocamos en la cubeta grande de electroforesis.

    2. Preparar un tampón 1xTAE

• En una probeta de 1000 ml, echamos 100 ml de tampón TAE y 900 ml de agua destilada.
• Agitamos y ese líquido lo echamos en la cubeta de electroforesis hasta que quede cubierto el gel de agarosa.

    3.  Preparar un tampón de carga con azul de metileno

• 900 ul de glicerol + 25 mg de azul de metileno, enrasamos hasta llegar a 10 ml con agua destilada.

Cuando ya tengamos todas las soluciones seguimos con la práctica

1. A continuación en el pocillo 1 y 16 echamos 10 ul de azul de metileno; en el pocillo 1 y 16  de la fila del medio echamos 10 ul de tampón comassie.
2. Sacamos los eppendorf del congelador y lo dejamos a temperatura ambiente.
3. Cogemos otros dos eppendorf y los rotulamos con a y b y le añadimos al a 5 ul de tampón de carga azul de metileno + 5 ul de ADN; en el otro echamos 5 ul de comassie + 5 ul de ADN.
4. Con una micropipeta cogemos todo del eppendorf a y lo echamos en el pocillo donde está el cátodo negativo (nº 15) y el b lo echamos en el pocillo 15 pero en la fila del medio.
5. Lo cerramos y lo conectamos 120 voltios durante 30 minutos.
6. Cuando termina la electroforesis se visualiza los fragmentos de ADN con una luz ultravioleta.

Práctica 50. Determinación rápida de hemoglobina

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE HEMOGLOBINA

Fundamento

Para determinar la concentración de hemoglobina justo antes de una donación.

Esta determinación rápida de Hb se basa en el hecho de que una sangre con una concentración de Hb superior a la permitida, para poder efectuar una donación, tiene una densidad mayor a la de una solución de sulfato de cobre previamente preparada. 

Para donantes varones se debe preparar una solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1.054 g/cm3, ya que a través de esta solución cae libremente una gota de sangre con Hb a una concentración superior a  g/cm3.

Para mujeres donantes se debe preparar una solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1.052 g/cm3, ya que a través de esta disolución cae libremente una gota de sangre con Hb a una concentración superior a 12 g/cm3.

Material

• Material de extracción de sangre capilar.
• Vaso de precipitado de 50 ml.

Reactivos

• Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1.052 g/dl. Se prepara de la siguiente forma:

1. Disolver 17 g de sulfato de cobre en 100 ml de agua destilada.

  La densidad de la solución de sulfato de cobre varía con la temperatura. Así pues, por ejemplo, para obtener la misma densidad a una temperatura ambiente de 22ºC, se han de añadir 0.74 ml más de agua destilada.

2. Mezclar 51 ml de la solución madre con 49 ml de agua destilada.

Muestra

• Sangra capilar.

Procedimiento

1. Echar el sulfato de cobre en un vaso de precipitado de 50 ml.
2. Dejar caer una gota de sangre en la disolución..

Resultados

Si la gota de sangre es más densa que la solución de sulfato de cobre, cae libremente a través de ella.

Pero si la gota de sangre es menos densa que la solución de sulfato de cobre, no cae al fondo del vaso de precipitados que contiene esta disolución.

Hoja de trabajo

1. ¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación?

- 12.5 g/dl

2. ¿Con qué otra disolución comparamos la densidad de la sangre?

- Sulfato de cobre de 1.052g/dl

Práctica 49. Prueba cruzada mayor

PRUEBA CRUZADA MAYOR

Fundamento

Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último frente al suero antiglobulina de Coombs.

Con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

Material

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Baño de agua.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla.
• Reloj.
• Vaso de precipitado.

Reactivos

• Solución salina.
• Albúmina bovina al 30%.
• Suero antiglobulina de Coombs.

Muestra

• Suero del receptor, obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis.
• Hematíes previamente lavados tres veces en solución salina y resuspendidos al 2-5%.

Procedimiento

1. En un tubo de hemólisis depositamos 1 gota de la suspensión de hematíes y 2 gotas del suero del recptor-
2. Mezclamos suavemente y dejamos a temepratura ambiente durante 2-3 minutos.
3. Centrifugamos a 3500 rpm durante 30 segundos.
4. Leemos el resultado obtenido en medio salino.
5. Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina bovina.
6. Mezclamos e incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
7. Leemos el resultado obtenido en medio albuminoso.
8. Lavamos tres veces los hematíes con solución salina para eliminar losa nticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos. Retirar el sobrenadante del último lavado.
9. Añadimos al tubo 1 gota de suero antiglobulina humana de Coombs y mezclamos.
10. Centrifugamos a 1000 rpm durante 2 minutos.
11. Leemos los resultados.

Resultados

La lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botón hemático después de cada una de las centrifugación.

En caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40x

La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles y por tanto, la transfusión es posible.

La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad.

Hoja de trabajo

1. ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor?

- Suero del receptor y hematíes del donante.

2. ¿Cuando se debe realizar la prueba cruzada menor?

- Cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligrosa.

3. ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoso?

- Para detectar todos los anticuerpos posibles.

4. ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs?

- Anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

Práctica 48. Determinación de un Du

DETERMINACIÓN DE UN Du

Fundamento

El Du es un antígeno D débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normles de determinación del Rh.
Por ello debemos sensibilizar previamente los hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos anti-D, posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs. Si existe el antígeno Du en la superficie de los eritrocitos, se producirá la unión de los anticuerpos anti-D a sus receptores de membrana y en la segunda fase darán lugar a la aglutinación en presencia del suero antiglobulina humana.
Es una prueba de Coombs indirecta.

Material

• Tubos de centrífuga.
• Centrífuga.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla.
• Baño de agua.
• Reloj.

Reactivos

• Suero anti-D humano.
• Suero antiglobulina humana
• Solución salina.

Muestra

• Hematíes de la sangre problema previamente lavados tres veces en solución salina y suspendidos al 5%.

Procedimiento

1. En un tubo añadimos 1 gota de suero anti-D y 1 gota de la suspensión de hematíes al 5%.
2. Mezclamos suavemente e incubamos a 37ºC durante 30-45 minutos.
3. Después lavamos los hematíes en solución salina tres veces y quitamos todo el sobrenadante en el último lavado.
4. Añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs y mezclamos suavemente.
5. Centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.
6. Leemos los resultados.

Resultados

Observamos la aparición o no de aglutinación mediante golpes suaves en el fondo del tubo. 

Si existe aglutinación, el resultado es positivo. Indica que en la membrana de los hematíes hay un antígeno Du, y se clasifica la sangre como Rh positivo variante Du.

En el caso de no existir aglutinación se clasifica la sangre como Rh negativo.

Para evitar falsos positivos debido a una sensibilización previa de los hematíes in vivo, debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema. Esto nos servirá como control negativo.

Hoja de trabajo

1. ¿Qué contiene el suero de Coombs?

- Anticuerpos antiglobulina humana

2. ¿Qué se detecta con la prueba directa?

- Anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo

3. ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?

- Anticuerpos incompletos libres en el suero

4. ¿Qué buscamos en la sangre del paciente?

- Si el paciente tiene un antígeno Du

5. ¿Qué ocurre si el control es positivo?

- Debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema.